胰腺癌中普遍存在p53基因异常，其发生、发展和对放、化疗的敏感性与p53基因密切相关。近年来，恢复肿瘤细胞的野生型p53基因表达已成为一种有效的基因治疗途径。本文对p53基因与胰腺癌的关系以及胰腺癌p53基因治疗的研究近况作一综述。
关键词 p53 胰腺癌 基因治疗

　　p53基因是人类肿瘤细胞中突变频率最高的基因。大量研究表明，p53功能失活的肿瘤细胞更具有侵袭性，并对放、化疗更不敏感。胰腺癌中普遍存在p53基因异常[1]，p53对胰腺癌的发生、发展及其对放、化疗敏感性的作用引起消化界的广泛关注。近年来，恢复肿瘤细胞的野生型p53基因表达已成为一种有效的基因治疗途径。本文对p53基因与胰腺癌的关系以及胰腺癌p53基因治疗的研究近况综述如下。

　　一、  53基因及其产物的结构和功能

　　（一） p53基因及产物的结构

　　人类的p53基因位于17号染色体短臂17p13.1，长20kb，由11个外显子和10个内含子组成。p53基因在进化中很保守,有五个高度保守区，它们可能对p53的功能起着很关键的作用。

　　p53基因的转录产物为2.5kb mRNA，编码393个氨基酸的核磷蛋白。p53蛋白的半衰期极短，相对分子量约53×103(53 kD)，具有与单链或双链DNA结合的能力。它包括四个主要功能区：N端是转录活性区（1－42AA），可与腺病毒的E1B-55kDa蛋白和人类的MDM2蛋白结合，阻止p53的转激活活性；中间是序列特异性DNA结合区（102－292AA），突变常发生在这个区域；C端包括一个寡聚区（323－356AA）和一个调控区（360－383AA）。正常细胞中p53蛋白含量很低，但在人类肿瘤及培养的转化细胞中可高达正常的5-100倍。

　　（二） p53基因及产物的功能

　　正常p53基因,即野生型p53，是一种抑癌基因,其功能类似“分子***”，监视并维持细胞基因组的完整性。DNA受到损伤后，野生型p53被激活，诱导细胞在G1期停滞，复制停止，以便有足够的时间修复损伤的DNA。如果修复失败，野生型p53就活化那些诱导凋亡的基因的转录，如上调靶基因Bax和p21(waf-1)，同时抑制Bcl-2基因，使细胞凋亡，从而阻止具有癌变倾向的基因突变细胞产生[2]。

　　p53基因最常见的突变为错意突变，然后第二个等位基因会丢失，突变的基因就变成了纯和体。p53功能失活存在于近半数以上的肿瘤细胞中，可见该基因在肿瘤的发病中占有重要地位。突变后的p53基因，即突变型p53，是一种癌基因，不仅引起p53抑癌活性的丧失，而且可以使编码产物的调节紊乱，细胞分化障碍，生长失控乃至癌变[3]。其蛋白产物的构型发生变化,半衰期延长, 稳定性升高，易在细胞核内堆积。通过免疫组化法可检测到它的过量表达，而野生型p53蛋白则不能被检测到。因此，p53蛋白免疫组化阳性，则提示肿瘤细胞有p53基因的突变。

　　二、  53基因与胰腺癌的关系

　　（一）ｐ53基因在胰腺癌中的表达

　　p53基因的失活通常被认为是胰腺癌发生中的晚期事件[4，5]。p53基因在胰腺癌中的突变率为60-80%[6]，阳性率报道不一可能与所选择样本量的大小和检测方法有关，至今尚未发现与性别、年龄的关系。Moore等[7]用直接序列分析和特异性甲基化聚合酶链反应对22株胰腺癌细胞系的基因改变进行研究，发现这些细胞系中的p53变异高达95%。Gerdes等[8]也通过PCR－SSCP、直接测序和免疫组化的方法分析了七例胰腺癌患者p53基因的变异情况。研究中的五例有p53变异。Wada [9]还发现胰腺癌的p53突变常伴有杂合子丢失(LOH)。这种高突变率说明p53基因在胰腺癌的发生发展中起着重要的作用。

　　Dong等[6]对p53基因在胰腺癌中的突变情况做了进一步研究。他们对72名胰腺癌患者的p53核心外显子4-9 (密码子33-331)进行直接DNA序列分析，发现62.5% (45/72) 的患者中有p53突变，包括38例点突变和7例移码突变。点突变包括68.9% (31/45) 转换和15.6% (7/45) 易位。39.5% (15/38)的点突变为第8外显子密码子273处的CGT (精氨酸)变为 CAT (组氨酸)。34.2% (13/38)的点突变为第7外显子密码子248处的CGG (精氨酸)变为TGG (色氨酸)。在7例移码突变中, 4例发生在外显子4, 2例发生在外显子5, 1例在外显子6。

　　（二）p53与胰腺癌的分期、诊断和预后

　　p53与胰腺癌分期之间的关系尚有争议。Nagy等[10]采用非放射性同位素印记法检测胰腺癌患者的p53拷贝数, 结果经logistic回归分析显示 ，肿瘤分级与p53基因的缺失呈正相关。但Dong等[6]的最新研究却显示p53异常与胰腺癌分化的程度无关。因此，两者之间的关系尚待进一步研究证实。

　　p53基因变异对胰腺癌的诊断和预后具有重要意义。p53蛋白的过度表达往往仅见于胰腺癌患者的胰液中，因此对胰液的p53基因检测是及早准确诊断胰腺癌颇有前景的方法[11]。Gazzaniga等[12]通过检测切除组织标本的野生型或突变型p53的表达并观察p53阴性和阳性患者的生存期，来研究p53突变对胰头癌患者胰头十二指肠切除术后生存期的作用。结果显示野生型p53的表达和患者生存期的延长显著相关，尤其对于没有淋巴结转移的患者。因此他们认为术前p53检测有利于决定哪些患者需要行扩大手术。虽然也有学者认为p53与预后的无显著相关性[13]，但是表达野生型p53患者的治疗效果的确相对较好[14]，毕竟p53基因并不是评估胰腺癌患者预后的独立因素[6]。

　　（三）p53与胰腺癌对放、化疗的敏感性

　　许多实验表明，化疗和放疗后，表达野生型p53的肿瘤可有大量细胞凋亡，产生明显的生长抑制。而p53表达缺陷的肿瘤在治疗后却往往仍然继续生长扩大，仅很少的细胞发生凋亡。p53突变显然与肿瘤的放、化疗耐受有关。Mohiuddin等[15]评估了野生或突变型p53对5-FU和放射线协同治疗胰腺癌效果的影响。研究中的三种胰腺癌细胞系为：含野生型p53的细胞系(Capan-2)和两株含突变p53的细胞系 (Panc-1和 MIA PaCa-2)。对三株细胞分别进行克隆基因测定以检测5-FU, 放射线，及放射线与5-FU合用对细胞生长和克隆形成能力的影响。结果发现，放射线提高了Capan-2细胞中p53和p21(waf1/cip1)的表达。而 在Panc-1细胞中无提高。MIA PaCa-2细胞中p21(waf1/cip1)下调，p53蛋白无增加。克隆基因测定表明，放射线上调了表达野生型p53的Capan-2细胞中胸核苷酸合酶(TS) mRNA的表达，而没有上调p53突变型细胞系中的 TS mRNA水平。 说明p53状态很大程度上影响放射敏感性 ，且有野生型p53表达的细胞比突变型细胞对放射线更加敏感。放射线和5-FU联合应用时，在野生型p53表达的细胞中为叠加效应，而在突变型细胞中为协同效应。

　　三、  胰腺癌的p53基因治疗

　　基因治疗是以基因作为靶点的治疗，通过修复有缺陷的基因功能达到治疗疾病的目的。胰腺癌预后极差，目前放、化疗的效果不佳。修复肿瘤抑制基因被认为是提高胰腺癌治疗效果的很有希望的方法。由于人类胰腺癌中普遍存在p53基因变异，因此p53成为胰腺癌基因治疗的首选，并已取得了令人满意的效果。

　　（一） 逆转肿瘤的恶性特征，抑制肿瘤生长

　　利用肿瘤细胞和正常细胞中p53有无突变的差别，可通过把野生型p53基因转入胰腺癌细胞，用其表达的野生型p53蛋白使肿瘤细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长，达到治疗目的。Ghaneh等[16]将重组腺病毒介导的野生型p53（Adp53） 转入5种胰腺癌细胞中，同时在小鼠皮下接种肿瘤，观察肿瘤细胞和移植瘤的生长情况。所有胰腺癌细胞系均出现了明显的生长抑制，Adp53转染引起肿瘤细胞大量凋亡。动物试验表明，注射Adp53后, 小鼠皮下移植瘤的生长明显受到抑制。这说明复制缺陷腺病毒载体是转染野生型p53基因的有效工具，p53基因治疗是通过诱导凋亡而抑制胰腺癌细胞生长的。

　　除腺病毒载体外，转染野生型p53也可使用非病毒基因转移载体。聚氮丙啶(PEI)衍生物的细胞毒性很小，是其中极具潜力的一种。

　　Merlin等[17]以转葡糖基酶 PEI为载体将p53基因转入p53缺失的胰腺癌PANC3细胞后，p53蛋白很快恢复了表达，之后被转染的细胞进入凋亡。

　　p53基因转染也可与一些前体药物活化酶联合使用。Mercade等[18]以细胞色素p450-2B1原位激活环磷酰胺后将腺病毒介导的野生型p53导人胰腺癌NP-18细胞系，分析细胞活性和细胞周期。在小鼠皮下接种肿瘤，观察肿瘤的生长情况并进行组织学分析和细胞周期分析。结果显示NP-18细胞系的细胞活性显著降低，G1期前的细胞明显增多。动物试验显示用细胞色素p450-2B1生物激活环磷酰胺后肿瘤体积快速缩小，导入p53后肿瘤持续减小。说明细胞色素p450-2B1原位激活环磷酰胺后导入p53可以识别DNA损伤，加速肿瘤的退化，可能成为治疗人类实体瘤的有效方法。

　　（二） 增强放、化疗敏感性

　　目前，放、化疗均不能显著改善胰腺癌的预后。突变的p53基因或失活的p53蛋白阻碍了DNA的修复或凋亡的诱导。这可能是一些肿瘤对放、化疗抵抗的重要原因之一。p53基因置换新疗法的出现令人振奋，因为p53可修复损伤的DNA，从而提高胰腺癌对放、化疗的敏感性。Cascallo等[19]将Adp53导入胰腺癌细胞并用两种基因毒性药物，吉西他滨和顺铂处理,然后进行活细胞测定。结果表明药物处理前转导野生型p53会产生耐药性, 但药物处理后转导p53可增加药物的细胞毒性作用。细胞周期检测显示外源性p53的表达引起细胞周期阻滞，S期的细胞百分比显著降低，使对药物敏感的细胞数减少。顺铂并非特异性地杀伤S期细胞，因此在p53基因导入后，细胞对顺铂的敏感性没有太大改变。而药物处理后再导入野生型p53的效果较好，因为后导入的p53可识别此前药物导致的DNA 损伤，并使G1期之前的细胞数增多。这与annexin检测结果和bax/bcl-2的比值相一致。同时，移植瘤试验证实了该方法在体内的有效性。因此，联合应用 p53转导和化学治疗时，要注意给药的顺序，才会得到满意的治疗效果。

　　一些非毒性p53基因活化剂也可通过活化p53基因诱导肿瘤细胞凋亡并促使已破坏的细胞恢复。因此，将放、化疗与非毒性p53基因活化剂联合应用可能一方面通过放、化疗破坏肿瘤细胞的DNA，另一方面非毒性p53基因活化剂可加速凋亡。Tsuda等[20]联合应用放、化疗和人工合成的抗瘤酮A10和AS2-1治疗晚期癌症患者取得了良好效果。 A10和AS2-1化学结构相似，均可合成抗肿瘤因子，活化p53基因，使细胞周期停滞于 G1期，减少有丝分裂从而抑制肿瘤生长。它们是适合临床应用的非毒性p53基因活化剂。这一方案可能维持癌症治疗的效果。

　　四、  小结

　　目前的研究表明，野生型p53是维持细胞增殖与分化平衡的关键因子之一。它不仅在胰腺癌的发生、发展中具有重要作用，对于改善和提高胰腺癌的治疗水平也具有重要价值。胰腺癌p53基因治疗的体外细胞和动物模型研究取得了令人鼓舞的结果，但到目前为止，仍处于探索阶段，还不能代替常规的治疗方案。相信随着对p53作用机理的深入研究，进一步阐明其与放、化疗的相互关系，将使p53基因治疗成为胰腺癌综合治疗的一个重要组成部分。

　　参 考 文 献（略）