摘要 目的：建立VEGF高表达的人卵巢癌细胞株OVCAR3裸鼠腹水移植瘤模型，探讨贝伐单抗联合顺铂对荷卵巢癌裸鼠腹水生长的抑制作用，并探讨其作用机制。方法：利用VPF/VEGF高表达的卵巢癌细胞株OVCAR3建立裸鼠腹水瘤模型。用贝伐单抗、顺铂、贝伐单抗联合顺铂及PBS分别处理各组裸鼠，观察其对腹水形成、腹水中VEGF含量、腹膜渗透性、脉管密度和肿瘤细胞及红细胞的作用，并比较与化疗药物顺铂联合应用的疗效。结果使用贝伐单抗治疗组裸鼠的腹水量、腹膜渗透性受到明显抑制，腹水中的红细胞、癌细胞、血管内皮生长因子水平及肿瘤组织内微血管密度明显减少，除腹膜渗透性外，贝伐单抗与顺铂联合治疗进一步加强上述治疗效果。结论：贝伐单抗联合细胞毒药物的生物化疗治疗模式有望成为治疗癌性腹水的一种新方法。

　　关键词　癌性腹水；抗血管生成治疗；贝伐单抗；顺铂；腹膜渗透性

　　卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，具有腹膜内癌扩散和形成大量腹水的特征。大量腹水造成的腹胀、呼吸困难、恶病质等症状严重影响患者的生活质量和疾病预后。尽管手术方法和化学治疗的改进，晚期复发的卵巢癌患者死亡率仍无明显改善。现有的治疗手段对卵巢癌腹水患者疗效差是其死亡率高居不下的主要原因。过去几十年来的研究证实，血管内皮生长因子/血管渗透性因子（VPF/VEGF）可刺激血管生成和增强血管渗透性，在腹水形成过程中起重要作用。VPF/VEGF通过增加膈肌和肿瘤相关脉管系统的渗透性，在腹水尤其卵巢癌腹水形成中起重要作用[1]。贝伐单抗（Bevacizumab）是一种人源化单克隆抗体，可特异性作用于VEGF以抑制血管生成和改变血管渗透性。于2004年经美国FDA批准用于晚期结直肠癌的一线治疗。国外大量报道了贝伐单抗对小鼠原发瘤和转移瘤的抑制作用，但对腹水瘤治疗报道极少。本实验采用VEGF高表达的人卵巢浆液性上皮癌细胞株OVCAR3建立卵巢癌裸鼠腹水瘤模型，研究anti-VEGF单克隆抗体贝伐单抗治疗卵巢癌腹水的效果和机制。结果显示VEGF表达增强的卵巢癌细胞腹膜腔内接种后可显著形成大量腹水。贝伐单抗抑制腹水和肿瘤负荷的效果说明其将在治疗卵巢癌和腹水方面具有一定的价值。

　　一、　材料与方法

　　(一)　材料

　　BALB/c（nu/nu）裸鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，4~6周龄；体重16~20g，雌性；饲养于SPF级环境中。人卵巢浆液性囊腺癌细胞株OVCAR3和HEY-A8细胞株由中科院上海细胞所提供（ATCC产品），经RT-PCR方法检测分别为VEGF高表达和低表达的细胞株。Bevacizumab由美国Genentech公司提供。顺铂由齐鲁制药厂生产。ELISA试剂盒购于晶美生物公司。

　　(二)　人卵巢浆液性囊腺癌细胞腹水瘤模型的建立

　　将OVCAR3细胞株快速冻融复苏，用RPMI1640（GBCO）培养液基（内含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，谷氨酰胺200mg，丙酮酸钠2ml）置于37C、4%CO2孵箱中培养，取对数生长期的细胞以0.25%胰酶、0.02%EDTA消化，2000r/min离心10min，弃上清液，用1640稀释，制成细胞悬液，用0.4%台盼兰染色后计数活细胞数>95%。取200μL细胞悬液注射于48只裸鼠腹腔（每只3×106个细胞）。同时采用VEGF低表达的卵巢癌细胞株HEY-A8进行腹膜内接种，接种方法同上，共接种10只，接种后观察腹部膨隆和体重变化。OVCAR3细胞种植后2周，裸鼠开始出现腹部膨隆，提示腹水形成。而HO-8910裸鼠无腹部膨隆等症状出现，尸解后OVCAR3裸鼠腹腔内可见腹水生成，并见腹腔内散在的瘤结节，而HEY-A8裸鼠未见腹水形成。

　　(三)　实验分组和给药方法

　　将48只裸鼠随机分为4组，每组12只，给予药物治疗。第一组为贝伐单抗组，按贝伐单抗5μg/g/次；第二组为顺铂组，按顺铂20μg/g/次；皆为每周一、二、四、五给药。第三组为贝伐单抗和顺铂的联合治疗，周二、周五同时给予贝伐单抗和顺铂治疗；第四组为对照组，每周一、二、四、五注射生理盐水1ml（调整贝伐单抗组和顺铂组注射药物的浓度，使每次注射的体积均为1ml），连续注射4周，停药后继续观察2周，2周后以颈椎脱位法处死裸鼠进行如下指标检测。

　　(四)　检测指标和检测方法

　　1．腹水平均体积：用颈椎脱位法处死每组一半的裸鼠后，用无菌注射器收集腹水，计算腹水平均体积。

　　2．腹水中瘤细胞、红细胞的记数：一部分用于记数腹水中瘤细胞，红细胞的数量。取部分腹水离心后取上清液，使用白细胞记数法进行记数。

　　3．腹水中VEGF浓度的检查：无菌收集腹水后，另一部分用于检查腹水中的VEGF浓度，采用VEGF ELISA法，具体见试剂盒说明。

　　4．腹膜渗透性的检测：将每组剩下的另6只裸鼠进行腹膜渗透性实验。从裸鼠的尾静脉缓慢注射0.25ml 5%的Evan蓝（5g/l），2小时后处死裸鼠，收集腹水，将腹水离心后用酶标仪检测540nm波长检测Evan蓝的吸光度，通过检测吸光度值间接反映Evan蓝的浓度，从而分析腹膜渗透性。

　　5．微血管密度（MVD）的检测：腹膜腔内肿瘤组织常规切片染色，所有切片厚度均为4μm，用CD34染色血管内皮细胞，记数微血管密度，CD34染色阳性位于血管内皮细胞胞浆。根据文献[2] ，微血管记数时，先在40倍光镜下寻找微血管密度分布最高的区域，再在200倍视野下选取边界清楚，非连续的管腔结构进行记数，任何染色的内皮细胞或内皮细胞簇，只要其和邻近的微血管，肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就可作为一个微血管，取4个视野记数后的平均值作为此肿瘤组织中的MVD值。具体操作见试剂盒说明。

　　(五)　统计学处理

　　采用SPSS10.0软件中完全随机设计资料的单向方差分析(One-way ANOVA)，实验数据以均值加减标准差表示（ ），多组间比较采用LSD法。

　　二、 结果

　　(一)　对腹水的抑制作用

　　三个治疗组对腹水皆有抑制作用，顺铂组，贝伐单抗，联合治疗组裸鼠腹水体积分别为：3.62±0.23，2.53±0.30，1.95±0.19；以贝伐单抗组和联合治疗组作用显著，尤以联合治疗组效果明显（P=0.000）。2.2对腹水中红细胞及肿瘤细胞的抑制作用腹水中红细胞和肿瘤细胞分别在107个和106个/ml水平以上，对照组红细胞为78.00±2.37，顺铂组，贝伐单抗组，联合治疗组分别为63.50±2.43，48.50±1.87，35.00±2.89，各治疗组跟对照组相比，腹水中红细胞明显少于对照组（P=0.000）；对照组中肿瘤细胞为78.50±1.87，顺铂组，贝伐单抗组，联合治疗组分别为69.00±2.61，59.33±3.01，40.17±2.64，各治疗组跟对照组相比差异明显，尤以联合治疗组差异显著（P=0.000）。

　　(二)　腹水中VEGF水平(ng/ml)

　　结果显示贝伐单抗组、顺铂组、联合治疗组和对照组的腹水中VEGF浓度分别为193.3±10.09、402.0±11. 59、138.8±10.28和411.2±10.80。贝伐单抗组较顺铂组和对照组明显减少腹水中VEGF含量（P=0.000），顺铂组和对照组之间无显著差异（P=0.154，P＞0.05）；贝伐单抗和顺铂的联合治疗可加强对腹水中VEGF含量的抑制（P=0.000）。

　　(三)　腹膜渗透性(OD值)的影响

　　结果显示贝伐单抗组、顺铂组、联合治疗组和对照组的腹膜渗透性OD值分别为：0.48±0.03、0.89±0.05、0.52±0.02、0.93±0.04。贝伐单抗组腹膜渗透性的OD值明显低于顺铂组和对照组（P=0.000），顺铂组和对照组（P=0.078；P＞0.05）；贝伐单抗组与联合治疗组之间无明显差异（P=0.090），说明顺铂对腹膜渗透性无明显影响。贝伐单抗可明显改善腹膜渗透性，与顺铂联合并无明显协同作用。

　　(四)　肿瘤组织内微血管密度（MVD）的测定

　　对照组MVD的平均值为33.00±3.74；而顺铂组MVD平均值为31.50±3.08；贝伐单抗治疗组MVD平均值为21.67±2.73；联合治疗组MVD平均值为16.83±2.48。顺铂组和对照组之间无明显差异（P＝0.073；P＞0.05）；贝伐单抗组和联合治疗组之间存在显著差异（P=0.000）。

　　三、　讨论　

　　研究已证实血管内皮生长因子（又名血管渗透性因子）VEGF/VPF在血管生成和腹水形成中的重要作用。VEGF在包括卵巢上皮癌在内的许多肿瘤中检测到其高表达，且表达水平直接与预后有关[3]，免疫组织化学方法记数的瘤内微血管密度被认为影响包括卵巢癌在内的许多肿瘤的转移和预后[4]。因此，VPF/VEGF和其受体成为抗血管生成治疗的理想靶位。我们采用VPF/VEGF高表达的卵巢浆液性囊腺癌细胞株OVCAR3成功诱导裸鼠腹膜扩散和腹水形成的动物模型，研究抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗对卵巢癌腹水的抑制作用。在预实验中，已确认OVCAR3细胞株高表达VPF/VEGF。另外，还使用VEGF不表达的细胞株HEY-A8进行对比实验。实验结果显示OVCAR3细胞株接种到裸鼠腹膜腔内2周后开始形成腹水，而HEY-A8细胞株腹腔内接种后却不生成腹水。结果证实使用anti-VEGF人源化单克隆抗体贝伐单抗可明显抑制腹水形成和减少腹水中VEGF的含量。这说明VEGF/VPF在卵巢癌腹水瘤生成中起重要作用。

　　VPF/VEGF是内皮细胞上特异性的有丝分裂素，和其受体Flt-1和KDR/Flk-1选择性位于血管内皮细胞上，激活VPF/VEGF和其受体皆可促进内皮细胞的有丝分裂，刺激血管生成的全过程[5]，增强微血管通透性[6]。针对VEGF的治疗策略包括直接对抗VEGF或其受体的单克隆抗体和小分子酪氨酸酶抑制剂。贝伐单抗是特异性针对VPF/VEGF的人源化单克隆抗体，是目前仅应用于临床阻断VEGF和其受体作用的靶向药物。既往的研究主要证实贝伐单抗在实体瘤抗血管生成方面的显著作用，最近，Yuan[7]和Brasch[8]等证明抗VEGF的鼠源性单抗A4.6.1（贝伐单抗前体）可减少人恶性肿瘤血管渗透性；脉管直径，导致血管退化。我们的观察结果也显示贝伐单抗最明显的作用是抑制腹水的形成，改变腹膜渗透性和脉管密度。结果显示，对照组和贝伐单抗治疗组腹膜渗透性（OD值）比较具有显著的差异（P＜0.05）。说明伊文思蓝通过与内皮细胞上内源性蛋白结合后通过腹膜血管渗透到腹水中，暗示腹水瘤的血管渗透性增强[9]，贝伐单抗治疗组可显著抑制腹水瘤的血管渗透性，其MVD也明显减少。

　　联合治疗组裸鼠腹水中VEGF含量明显少于对照组、贝伐单抗组和顺铂组的联合治疗在抑制腹水生成，腹水中红细胞和肿瘤细胞方面作用显著。联合治疗的机制目前还不十分明确。Gerber 等[10] 认为细胞毒药物需进入肿瘤组织内部才能更好的发挥疗效，而肿瘤血管在结构和功能上是异常的，血管生成和抗血管生成因子之间的不平衡导致血管结构不规则、血管渗漏，结构和渗透性的不完整使间质液压力升高，与肿瘤所致的血管压迫一起，妨碍细胞毒药物渗透进肿瘤内部而影响化疗效果。而抗VEGF单克隆抗体治疗可使血管重构并渐趋正常化，这样更有利于细胞毒药物进入肿瘤组织，从而促使肿瘤内皮细胞出现凋亡，脉管直径、密度和渗透性下降。另一方面，顺铂直接作用于肿瘤细胞，造成肿瘤细胞坏死，与贝伐单抗可起到协同作用。抗VEGF单抗治疗较传统治疗的明显优势是可直接作用于肿瘤脉管系统，不需渗透进肿瘤细胞本身。

　　本研究提示贝伐单抗抗血管生成和抑制血管渗透性的治疗有望成为治疗恶性腹水的方法之一，值得进一步研究。与化疗联合应用可加强治疗效果，为临床综合治疗癌性腹水提供了新思路。

　　参考文献　略