结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势，我国为50．8／10万，居恶性肿瘤的第4位，在欧美国家则居第2位。美国每年约有新发病133 200例，每年有50 000人死于结直肠癌；在65岁以上的老年人中其发病率占第3位，死亡率占第2位。结直肠癌术后复发和转移是导致患者死亡的主要原因，在接受根治性手术的患者中，仍有5O％患者死于术后肿瘤局部复发和转移，即使Dukes A 期和B期的结直肠癌患者中术后仍有一定的复发和转移率，其原因可能与早期结直肠癌患者即已存在肿瘤微转移有关。有研究显示，3O～4O％的患者虽然临床上难以检测出转移灶，但已存在微转移。因此，尽早检测和发现微转移，并施以针对性治疗，是提高结直肠癌疗效、改善预后的重要环节。现就结直肠癌微转移的基本概念、发生机制及早期检测方法综述如下。

　　一、微转移的概念

　　1961年Huvos首次提出肿瘤微转移的概念，当时用来描述乳腺癌患者淋巴结中直径<2 mm的转移灶。近年来随着免疫组织化学及分子生物学的发展，微转移的概念已有所扩展。目前微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝及肺等组织器官中，且应用常规临床和病理学方法不能检出的微小肿瘤病灶。然而，关于微转移病灶的大小仍有不同界定，多数认为病灶直径<2 mm即为微转移，而Greene等认为应界定为0．2～2．0 mm。最近的研究发现，直径d0．2 mm 的微小肿瘤细胞灶可被机体的免疫系统清除而不具备转移活性，仅能称之为孤立肿瘤细胞(isolated tumor cells，ITCs)，而不属于微转移。此外，机体各部分每天都有不少细胞发生突变，这些微小病变并非来源于原发灶，故亦不应属于微转移。因此，微转移需具有下列特点：①来源于原发灶；②常无任何临床表现；③能够逃避机体的免疫监视并最终发展成肉眼可见的病变；④常规检查方法如CT、MRI及普通病理检查等均难以发现。

　　二、微转移的发生机制

　　结直肠癌微转移的发生机制尚未完全阐明，一般认为结直肠癌发生微转移并最终发展为临床可以发现的转移病灶需经过下列几个阶段：①肿瘤细胞去黏附，从原发灶脱离；②肿瘤细胞与细胞外基质(EMC)发生黏附；③细胞与EMC中大分子作用，分泌蛋白降解酶类，降解EMC成分，形成肿瘤细胞移动的通道，并以此为诱导血管生成的基础；④肿瘤细胞在黏附降解的过程中移动，穿透EMC及血管壁的基底膜(BM)，进入循环；⑤在循环中运行，并逃避免疫系统的攻击；⑥ 到达继发部位后，在选址素和内皮细胞作用下，肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附，降解血管BM而穿出血管壁；⑦肿瘤细胞与继发部位EMC黏附，在有新生血管形成的前提下增殖，形成转移灶。概括起来为黏附、降解、移动和血管生成。侵入远处组织的癌细胞大多处于休眠状态，即增殖与凋亡的平衡状态。它们能否打破平衡，增殖形成转移灶，取决于肿瘤细胞活性和机体免疫状态等多种因素。Keith等将B16F1黑色素瘤细胞注入鼠门静脉以期到达肝脏，结果发现：①仅80%的注入瘤细胞在肝微循环中存活；②实验第3天，仅2．5％的瘤细胞形成微转移；③实验第13天，仅1 9／6的微转移形成肉眼可见的肿瘤。

　　三、结直肠癌微转移的检测方法

　　1、淋巴结廓清技术：即二甲苯一乙醇清除技术，采用甲醛溶液固定标本后用乙醇反复冲洗，再用二甲苯将肠系膜的脂肪溶解、清除。该方法可将送检标本中几乎所有的淋巴结检出，通过增加受检的淋巴结数目达到检出转移灶的目的

　　2．病理标本的连续切片法：对淋巴结标本进行连续切片，并常规苏木精一伊红(HE)染色后在光学微镜下观察。Gusterson对结直肠癌术后的标本进行连续切片检查，发现应用常规病理学检查显示淋巴结转移阴性的患者中，仍有2O%存在微转移。Isozaki曾对术后的淋巴结分别行常规切片和连续切片，发现常规切片的转移检出率为8．4％，而连续切片为23．8%，提示连续切片法较常规切片法可显著提高微转移的检出率。但文献中对连续切片的间距及切片数量意见不一。Meyer建议间隔250 m连续切片3～4张，而Frenaux等ElO]认为间隔150 m较合适，Giard等则建议间隔300 m连续切片3张。但连续切片检查繁琐费时、工作量大，难以作为临床常规检查。

　　3．免疫组织化学法：肿瘤细胞往往表达与其起源组织及其分化过程相关的标志物。免疫组织化学法是利用这种标志物的抗原抗体反应，对组织内的细胞或其他组织成分进行定位的一种方法，可鉴别单个的细胞。该技术可从1×1O ～1×105个淋巴细胞中找出1个肿瘤细胞，在检查骨髓抽吸液时，可从1×1O 个正常细胞中检出1个肿瘤细胞。该方法虽比传统病理诊断具有更高的敏感度，但其诊断的特异度低于常规组织切片染色。丁彦青等对68例结肠癌术后经常规病理检查诊断为转移阴性的584枚淋巴结，应用抗细胞角蛋白(CK)和癌胚抗原(CEA)的单抗行免疫组织化学检测，13例29枚淋巴结存在微转移，随访5年发现，免疫组织化学诊断阳性组复发率为84．6％(11／13例)，而阴性组为5．5 (3／55例)。该检测方法具有敏感度高、应用范围广等优点，但需制备大量的抗体，且染色复杂。有研究发现，连续切片及免疫组织化学的联合应用可提高9～33%的淋巴结微转移检出率。

　　4．原位杂交法(Southern blot)：从肿瘤组织中提取基因组DNA，酶解后行凝胶电泳分离，再应用特异基因探针杂交，敏感度为1～5 ng／mLE。该方法在操作过程中要避免外源性细胞污染标本，否则会产生假阳性结果。其只适用于动物模型，不应用于人体的临床检测。

　　5．聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、逆转录(RT)一PCR和巢式PCR等。普通PCR技术是应用一对引物，在体外酶作用下促合成特定的DNA片段，该过程需反复进行2O个周期以上，使原始靶DNA 序列扩增l×106～1×108倍。由Mullis于1985年发明并获诺贝尔奖，1988年首次报道应用PCR检测慢性白血病细胞，1991年Smith等首次将PCR技术用于检测实体瘤，之后其被广泛应用于微转移研究。PCR法临床检测微转移要求待测基因在待测肿瘤中突变率高，且基因的碱基改变相对集中。采用PCR技术检测120例结直肠癌的K-ras基因及p53抑癌基因，检出71例有微转移，其中5O % 以上于5年内复发，而阴性表达者无一例复发。RT-PCR技术是通过扩增肿瘤细胞标志物基因mRNA的方法检测组织或血液中存在的肿瘤细胞。其敏感度约为1×10—6，比Southern blot敏感度提高约10 000倍。应用CK20或CK19 mRNA的RT—PCR法可在1 mL全血中检出1个上皮来源的肿瘤细胞。应用CEA tRNA的RT-PCR检测结直肠癌的淋巴结，3O个常规病理为阳性的淋巴结RT—PCR亦为阳性，87个常规病理为阴性的淋巴结RT—PCR检测出47个为阳性；另一组应用该法检测腹部肿瘤患者的骨髓，11例免疫组织化学检测为阴性的标本用RT-PCR法检测有4例为阳性，说明RT—PCR法较免疫组织化学法敏感。显然，RT-PCR法具有细胞形态学及免疫组织化学技术所不可比拟的敏感性，其敏感度可达1×1O～1×10 8，所以RT—PCR技术被认为是目前发现的早期检测结直肠癌微转移的最佳方法。巢式PCT技术是通过设计内外2条引物进行2轮PCR扩增，可将敏感度再提高1O～100倍，但随之而来的是假阳性率的迅速升高。

　　6．放射免疫检测：是将放射性元素标记的探针注入体内，通过对放射性物质的测定来检测微转移灶。有时会因动物源性单抗进入人体后产生自身抗体，再次应用时发生过敏反应而影响免疫显像效果。

　　四、结直肠癌微转移标志物的检测

　　可用于检测结直肠癌微转移的生物学标志物并不多，但近年来仍有一定发展。常用的免疫组织化学和分子生物学指标有CEA、CK20、CKI9、基质金属蛋白酶一2(MMP-2)和鸟昔酸环化酶c(GCC)等。

　　1．CEA：由Gold等于1965年首先在结肠癌中发现，是一种相对分子质量约为180 000的糖蛋白分子，广泛分布于上皮性恶性肿瘤组织中，而在非上皮性组织，不论良、恶性病变组织均不能检出，故检测CEA对消化系统恶性肿瘤具有较高的特异性。陈路等[以CEA mRNA为肿瘤细胞的标志物，采用RT-PCR法检测38例结直肠癌患者术前外周血、术中门静脉血和术后外周血中微转移肿瘤细胞，结果显示血循环中CEA mRNA的阳性检出率与结直肠癌的Dukes分期密切相关，即使Dukes A期的患者也有1／3术前外周血和术中门静脉血中CEA mRNA表达阳性。随访发现，术后外周血中CEA mRNA 阳性者肝转移的发生率明显高于阴性者。由于CEA在较小的胆池中的浓度高于较大的外周血清池，且肝转移灶的癌细胞可直接通过分泌途径将CEA排入胆汁，导致胆汁中的CEA表达水平升高。所以，测定胆汁中的CEA水平对检测是否存在结直肠癌的肝脏微转移有较强针对性。

　　2．CK：分布于外胚层起源细胞的中间纤维丝，为上皮细胞的骨架蛋白，有2O种，其中CK20由Moll等于1990年发现并分离。与其他CK相比，CK2O具有更严格的上皮组织特异性，主要分布于胃肠道黏膜上皮细胞内，还可见于泌尿道伞状细胞、表皮Merkel细胞及舌味蕾细胞内；其他正常组织如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞及造血细胞均为阴性。在人类肿瘤中，不同部位肿瘤CK20表达差异较大，在消化道癌、泌尿道移行细胞癌和黑色素瘤中CK2O阳性，而在其他类型癌中则为阴性，该分布特点使其成为结直肠癌微转移新的诊断标志物。CKI9是上皮细胞中间丝的成分，属低分子量角蛋白，在各部位的腺上皮和腺上皮起源的恶性肿瘤中均有表达，而在正常淋巴细胞中不表达。邬宇飞等应用免疫组织化学法检测5O例结肠癌患者肿瘤组织及癌周255枚淋巴结的CK19表达，5O例结肠癌组织的CK19表达阳性率达100%；255例淋巴结中HE染色检查阳性者同时表达CK19阳性；另20%淋巴结HE染色阴性而CK19表达阳性；l2例患者淋巴结发生微转移，其中6例常规组织学检查淋巴结阴性而免疫组织化学法检测CKI9表现为转移阳性，采用抗体免疫组织化学染色法进行检测，分别发现56枚(22．O%)和76枚(29．8%)淋巴结阳性。提示此法不失为检测结直肠癌淋巴结微转移的敏感而便捷的方法。

　　3．MMP-2：为一类包括21种依赖金属锌离子的蛋白水解酶家族，分为胶原酶、基质溶解素、明胶酶、膜型金属蛋白酶及弹力蛋白酶等5类。MMPs通过降解基底膜屏障以及与多种细胞因子的作用，促进肿瘤内新生血管的形成及肿瘤细胞的增生，参与逃避宿主的免疫监视，促进肿瘤的生
长和侵袭。Westerlund等采用免疫组织化学法研究发现，MMP一2表达与恶性肿瘤的复发密切相关，其中复发患者的表达率为83%，表达MMP-2的患者较不表达者易复发；53%的MMP-2阳性表达者发生转移，且恶性肿瘤中MMP一2表达与预后呈负相关；MMP一2表达与结直肠癌患者外周血CK20 mRNA 的表达呈正相关。因此，结直肠癌组织中MMP-2表达程度同时反映血液微转移的情况。

　　4．GCC：其是受体鸟苷酸环化酶家族成员之一，文献报道仅在正常小肠黏膜上皮及原发和继发性结直肠癌中表达。体内的GCC抗体可能通过cGMP依赖的相关机制来调节结直癌细胞的增殖和分化。宗祥云等对25例结肠癌术后经常规病理诊断为转移阴性的370枚淋巴结进行GCC检测，14例45%淋巴结阳性，阳性率为12．2(45／370例)。可见以GCC判断结直肠癌微转移具有较高特异性。

　　综上所述，检测结直肠癌微转移的方法多种多样，但均存在一定不足。常规病理连续切片工作量大、敏感性低，且有较高假阴性率；PCR方法敏感性高，但易有假阳性。相信随着微转移研究方法的不断完善和深入，结直肠癌微转移的检测必将成为认识和指导结直肠癌治疗的有力手段。